付小兵（1960.08.14- ）中國工程院院士，創傷和組織修復與再生醫學專家，四川省資陽市人。1983年畢業于第三軍醫大學，馬德里大學博士。現任解放軍總醫院生命科學院院長、教授、創傷外科研究員、博士生導師。擔任國際創傷愈合聯盟執委、亞洲創傷愈合聯盟主席、國務院學位委員會學科評議組成員，國家技術發明獎、國家科技進步獎評委，中國生物材料學會候任理事長、中國博士后基金會理事、中華醫學會組織修復與再生分會主任委員、中華醫學會創傷學分會名譽主任委員、國家973“創傷和組織修復與再生項目”首席科學家，國家重點研發計劃項目負責人，國家自然科學基金創新群體負責人。1995年國家杰出青年基金獲得者。（引自搜狗百科）

基于間充質干細胞(MSC)的治療被認為是針對多種難治性疾病的有前途的方法，因為間充質干細胞具有顯著的多種效應，例如多向分化、免疫調節特性和促再生能力。

然而移植物植入不良，移植間充質干細胞存活率低，以及宿主年齡/疾病下供體-MSC潛能受損導致治療結果還不夠令人滿意。

增強策略，包括遺傳操作、預激活和培養方法的改變，已被研究以產生高功能的MSC。

解放軍總醫院付小兵院士：提高間充質干細胞療效，為臨床提供滿意效果！

中國工程院、解放軍總醫院生命科學院院長付小兵院士帶領團隊成員發文總結了目前間充質干細胞預激活的方法并進一步分類，分析了這些操作的科學原理和主要特點，并闡述了各種預激活策略的優缺點。

本文摘錄其中部分內容做一分享！

多種不利條件將導致各種問題，例如：

• 移植細胞的存活率低
• 間充質干細胞的遷移和歸巢差，并限制了注射細胞的功能。
• 來自不同個體的間充質干細胞在它們的生物學效應上是不同的，如來自老年供體的MSCs顯示出增殖和分化受損、免疫調節抑制和生物活性分子分泌減少。
• 再則由于暴露于惡劣的宿主微環境，包括缺氧、氧化應激以及慢性炎癥，MSCs可能很快發生凋亡。
• 此外，大多數輸注的間充質干細胞滯留在肺微血管而不是靶組織中。

嘗試優化干細胞的策略大致分為兩類，即基因修飾和非基因修飾(預激活)。

在基因修飾方面，間充質干細胞將產生或過量表達功能基因，使其能夠抵抗不利的微環境和凋亡，增加遷移和歸巢，并增強旁分泌效應。幾項研究表明，基因轉染的間充質干細胞比野生型間充質干細胞具有更好的治療潛力。

然而，安全性是轉基因間充質干細胞未來臨床治療應用的最大障礙。據報道，病毒表達系統可以在宿主中引發免疫和炎癥反應，并且病毒在宿主基因組中的整合會造成腫瘤風險。此外，基因工程間充質干細胞的治療潛力和長期功能改善需要充分闡明。

開發高效的非基因修飾方法，在這里統稱為預激活，是改善間充質干細胞治療結果的一種替代和可操作的方法。

間充質干細胞可以被預激活以實現所需的功能并逆轉其失活，因為它們可以識別微環境中的刺激并記住它們。

回顧目前的文獻，間充質干細胞的預激活主要是基于間充質干細胞存活的體內生理微環境而在體外模擬的，稱為“生理微環境模擬預激活”。或者說間充質干細胞的體外適應性調節是基于疾病的病理微環境，稱為“病理微環境模擬預激活”。

生理微環境模擬預激活

原代培養的間充質干細胞數量有限。它需要在體外擴增以達到治療相關的細胞數量，過度的離體操作導致衰老、干細胞減少和再生能力受損。

在體外保持MSCs的“年輕”是非常重要的。在這方面，在體外重建復雜的體內微環境將為MSC的生產提供一個強有力的工具，并保持其固有的生物學特性。低氧和三維(3D)培養是迄今研究得最深入的。

缺氧預激活

在體外培養條件下，MSCs通常暴露于平均氧分壓約為21%的環境中。然而，間充質干細胞通常存在于低氧微環境中，其生理氧濃度在體內為1-11 %。

幾項研究表明，高氧濃度在培養的MSCs中引起環境應激，然后誘導DNA損傷和衰老，并減少他們的活動。因此，缺氧是MSCs生理微環境的重要組成部分。

低氧預激活對間充質干細胞有多種有益作用。包括有：低氧培養環境維持MSCs的未分化狀態。

低氧促進了MSCs的增殖和存活，與常氧狀態(20%?O2)相比，導致了更高的擴增和更多的ASCs產量，在體外遷移試驗中，低氧預充促進了MSCs的動員，改善MSCs在體內的歸巢。

低氧預充可以保護MSCs對抗不利的微環境，維持基因的穩定性。當暴露于低氧時，MSCs表現出延長的壽命并避免復制性衰老，與常氧培養相比，表達較少的衰老相關β-半乳糖苷酶。缺氧條件下的間充質干細胞表現出基因穩定性，DNA損傷減少，染色體畸變減少。

低氧培養后，MSCs的分泌模式發生變化，旁分泌功能增強。例如，在缺氧條件下，MSCs中促血管生成因子如VEGF、HGF和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的分泌增加。相反，抗血管生成因子，如血小板反應蛋白-1和纖溶酶原激活物抑制劑-1，在間充質干細胞中減少。此外MSCs在低氧情況下的免疫抑制特性得到改善。

大量實驗研究發現，低氧預激活的MSCs比未經處理的MSCs顯示出更顯著的治療效果。在肺纖維化模型中，與常氧培養的MSCs相比，低氧預激活的MSCs可以明顯減輕肺水腫，減輕肺纖維化，并改善肺功能。此外，與含氧量正常的骨髓間充質干細胞相比，將含氧量低的骨髓間充質干細胞移植入大鼠心肌梗死模型后，損傷部位的血管生成增加，梗死面積減小。

因此，與常氧的MSCs相比，缺氧預處理的MSCs表現出更好的特性并具有更好的治療潛力。此外，低氧預激活具有簡單、成本低、易于推廣、適合大規模細胞生產的優點。然而，在低氧間充質干細胞進一步應用于臨床之前，有幾個問題需要解決。有必要優化低氧預激活中的氧濃度，因為MSCs生活的生理龕中的氧濃度因組織來源而異(骨髓中1%至7%，脂肪組織中10%至15%，出生相關組織中1.5%至5%)，此外，還應該揭示缺氧的最佳持續時間。更重要的是，生物安全是基于干細胞的治療最關心的問題，在臨床應用前應仔細確定。

3D培養預激活

與二維(2D)培養環境相比，三維培養系統模擬了體內的天然MSC微環境，并提供了增強的細胞間相互作用或細胞-ECM相互作用，這可以顯著改善MSCs的生物學行為，如增殖、免疫調節和定向分化。

MSCs的三維培養體系，包括多細胞球體、支架和水凝膠，已經引起了越來越多的關注。

• 球形培養

球體培養是一種相對簡單的增強間充質干細胞生物學活性的方法。已經開發了各種方法來產生MSC球體，例如懸滴技術、低附著方法以及強制聚集技術。隨著生物材料的發展，基于支架的MSC球體培養平臺得到了發展。

球形培養系統可以通過增加干細胞和促進分化成不同的細胞譜系而有益于間充質干細胞的治療潛力。Cheng等人的研究結果表明，殼聚糖膜球形培養可使MSCs去分化為更原始的狀態，間充質譜系標志物CD29、CD90和CD105下調，多能性相關標志物Sox2、Oct4、Nanog上調。球狀體來源的MSCs改變了它們的分化偏好，并可以轉分化為非間充質譜系細胞，如神經細胞和肝細胞。

球形培養系統可以通過提高增殖、遷移和歸巢效率而有益于MSCs的治療潛力。與單層MSC培養相比，球體來源的MSC表現出更高的增殖活性。

球形培養系統可以通過促進治療因子的分泌，包括免疫調節和促血管生成細胞因子，來助力MSCs的治療潛力。

球形培養優化了間充質干細胞的生物學特性，使其在體內具有更好的治療效果。

然而，球體培養系統的一些缺點限制了用于體內應用的MSC球體的大規模生產。例如，球體培養技術影響球體大小，球體大小的可變性影響MSCs的治療性能。因此，在臨床實踐中使用球體來源的MSC之前，有必要區分臨床需求，開發可重復的球體培養系統，并利用動物模型和臨床試驗來確認其安全性和有效性。

• 基于支架的培養

細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)是干細胞生態位的重要非細胞成分之一，被認為是干細胞的“土壤”。

生物材料的最新進展促進了MSCs人工ECM培養系統的發展，出現了多種天然和合成生物材料。它們應該滿足基質力學、可降解性和生物相容性的特性。

現有的工程化細胞外基質可以改善間充質干細胞的生物學特性，如增殖、歸巢、譜系分化和旁分泌。

支架、薄膜、水凝膠和海綿形式的工程化ECM已被開發并用于擴增MSCs并增強其生物學特性，藻酸鹽已廣泛用作組織工程中的生物相容性載體。

接種在工程化ECM支架上的間充質干細胞的旁分泌和免疫調節作用也顯著改變。接種在生物材料中的MSCs顯示出抗炎調節因子如PGE2和TSG-6的上調，以及抗炎調節因子如單核細胞趨化蛋白-1?(MCP-1)、IL-6和核因子κB受體激活因子(NF-κB)配體(RANKL)的下調。

因此，基于支架的三維培養賦予MSCs比2D培養更優異的生物學活性和更突出的治療效果。隨著人們對生物材料的認識，其生物學性能也在不斷拓展。僅使用生物材料，就可以制造出具有多種功能的仿生復合材料。

病理微環境模擬預激活

MSC既然進入體內，就會面臨疾病導致的病理微環境。在這種情況下，有多種破壞性因素可導致移植細胞的氧化應激和凋亡，并顯著損害MSCs固有的治療特性。

研究人員致力于針對惡劣環境微調細胞的特性，使其適合目標疾病。基于MSCs的可塑性和記憶能力，創傷微環境中的信號，如環境因素(缺氧)、化學因素(炎癥因子和細胞因子)，將是MSCs體外操作的首要考慮因素。

此外，新的途徑也在不斷探索，如藥物、中藥、小分子化合物等也成為MSC啟動的新興途徑。

另一個值得關注的問題是，患者內源性MSCs的生物學特性會隨著疾病的發展而改變，表現出功能的喪失和下降。

因此，改善間充質干細胞的生物學活性，提高其治療效果，特別是開發患者個性化的治療性間充質干細胞具有重要意義。

缺氧預激活間充質干細胞

缺氧也是病理環境的重要組成部分。

體外低氧培養可以誘導MSC對損傷微環境的記憶，從而獲得更好的治療效果。

然而，干細胞龕和受損組織之間的氧濃度是不同的。此外，受損組織中的局部氧濃度在不同的修復期有所不同。因此，干細胞預處理的氧濃度因目的而異。、

炎癥因子預激活間充質干細胞

炎癥因子和細胞因子的預激活被認為是模擬體內炎癥微環境的最常見手段，在調節干細胞的免疫調節功能中發揮重要作用。

• TNF-α

越來越多的證據表明，用疾病相關的刺激對間充質干細胞進行適當的預處理可以改善其生物學功能，起到更好的治療作用。TNF-α在缺血和損傷組織中表達，通常用于模擬急性炎癥環境。

• 干擾素γ

促炎細胞因子IFN-γ也是用于MSC預激活的代表性因子。間充質干細胞對IFN-γ有明顯的免疫抑制反應，一些抗炎因子如HGF、TGF-β1、IDO、前列腺素和環氧化酶2 (COX-2)的表達增加。多個證據表明，間充質干細胞可以被炎癥信號激活，并足以加強其免疫調節特性和治療效果。

• 白細胞介素-1β

IL-1β也是單核細胞和巨噬細胞產生的炎癥組織中普遍存在的炎性細胞因子。已有研究表明，IL-1β預激活增加了MSCs中許多粘附分子的表達。

• 其他促炎細胞因子和TLR配體

此外，一些其他炎癥因子如IL-17A和IL-25最近被報道為替代的預激活手段，并獲得了有希望的結果。

• 聯合促炎細胞因子

MSCs經各種促炎因子預激活后，其生物學活性各不相同，因此科學家們設想是否可以通過聯合不同的炎癥細胞因子對MSCs進行預處理，以彌補較低的效率并使治療效果最大化。

因此，炎癥細胞因子預激活不僅可以提高間充質干細胞抵抗氧化應激的能力，還可以在很大程度上增強間充質干細胞的免疫抑制特性，增強其治療效果。

用生長因子或再生細胞因子預激活間充質干細胞

最近出現了用生長因子或再生細胞因子預充間充質干細胞，并證明是一種有吸引力的方法。如bFGF、SDF-1、SDF-1α、p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等。

同樣的，用生長因子混合物預激活MSCs顯示了增強其生物學功能的協同效應。

然而，選擇最佳的細胞因子來預激活MSCs并賦予其所需的生物學功能是一個重要的步驟。是選擇在各種疾病中共同變化的細胞因子，還是使用疾病特異性細胞因子作為預激活條件，是一個需要深入研究的問題。或者，細胞因子預激活的方法不夠經濟，因為大規模生產預激活的MSCs需要大量的細胞因子。

用生物活性化合物預激活間充質干細胞

生物活性化合物是一種很有前途的預激活方法，用于增強間充質干細胞的生物學特性。

目前，用于刺激間充質干細胞的生物活性化合物根據其來源可分為天然(如從中藥中提取的)和合成化合物；從生物活性化合物的篩選原理來說，要么對MSCs有生物調節作用，要么對靶疾病有治療作用；鑒于其對間充質干細胞的生物學機制，生物活性化合物可分類如下：促進存活和遷移，增強分泌活性，逆轉和修復受損的間充質干細胞。

• 促進間充質干細胞存活和遷移

實際上，發揮間充質干細胞固有的治療特性需要移植細胞在惡劣和受損的環境中存活和發揮功能。許多研究集中于通過使用生物活性化合物來修飾MSCs以增強其抗凋亡和遷移能力。譬如曲美他嗪、他達拉非、阿托伐他汀、維生素E等。近年來，中藥或其提取物對間充質干細胞的有益作用已被研究。譬如丹參、姜黃素、迷迭香酸(RA)和gigantol等等，都可以發展為細胞保護劑，為成功的間充質干細胞移植。

• 增強間充質干細胞的免疫調節、旁分泌和治療潛力

事實上，間充質干細胞的免疫調節和旁分泌特性與其治療效果密切相關。最近的數據表明，藥物刺激可以促進間充質干細胞的旁分泌和免疫調節潛力。譬如鐵螯合劑去鐵胺(DFX)、前列環素類似物曲前列環素、白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)、補陽還五湯(BHD)等等。

• 逆轉和修復受損間充質干細胞

隨著體外大規模擴增，來自圍產期組織的MSCs將發生復制性衰老，來自老年供體的MSCs普遍呈現早衰表型，來自患者的MSCs表現出MSC生物學功能的下降。這些間充質干細胞通常在增殖、遷移、分化和免疫調節方面表現出下調的細胞功能，治療能力受損。因此，逆轉這些間充質干細胞的功能，即間充質干細胞的再生，對于基于間充質干細胞的治療至關重要。幸運的是，最近的研究表明，細胞功能衰退或早衰是可以挽救的。一般來說，拯救MSCs的方法可以廣義地定義為降低細胞內氧化應激的水平，可以通過表觀遺傳修飾的調節來重編程MSCs，以及使用抗衰老藥物等。

• 抑制過度氧化應激

數據顯示，ROS作為細胞代謝產生的天然副產物，在MSCs中維持在低水平，并且對于MSCs的增殖和分化是必需的。在年齡老化或病理條件下誘導的高水平ROS將導致嚴重的細胞毒性和細胞損傷。幾項研究報道，功能異常的MSCs可以通過調節細胞內ROS聚集和氧化代謝而逆轉。抗氧化劑已成為自然的選擇，幾種抗氧化劑用于MSCs的抗衰老研究。如n-乙酰半胱氨酸(NAC)和依達拉奉等。總的來說，ROS可以作為細胞內信使，幫助執行重要的生物功能，不過通過調節抗氧化劑的量來控制ROS的最佳濃度至關重要。

• 改變表觀遺傳失調

表觀遺傳調控是一種重要的編程機制，它通過改變基因表達而不是DNA序列來改變細胞表型。其特點是遺傳性和可逆性，包括DNA甲基化和組蛋白修飾，并對MSC的命運有深遠的影響。與年輕來源的間充質干細胞相比，老年來源的間充質干細胞的DNA甲基化普遍降低。

利用目前的技術，對老化干細胞進行重新編程的方法主要有兩種方式，完全重新編程和部分重新編程。前者是指表觀遺傳時鐘的重置，最終獲得誘導多能干細胞(iPSCs)。而后者部分重編程涉及不完全去分化，被認為是表觀遺傳返老還童，這可以通過使用生物活性化合物調節DNA甲基化和組蛋白修飾來實現。

抗衰老藥物的使用

抗衰老療法是指應用抗衰老藥物來選擇性地消耗衰老細胞或延遲衰老的開始，從而使組織再生并減少與年齡相關的病理的發生。

據報道，一些化合物具有潛在的抗衰作用，如navitas (ABT-263)、槲皮素、達那唑、煙酰胺核苷、達沙替尼和二甲雙胍。不同藥物的組合可以達到更顯著的療效。譬如一些發現表明，達沙替尼和槲皮素的混合物可以減輕衰老細胞的負擔，并改善重要組織如脂肪、骨、主動脈和腦的功能。

總的來說，這些發現表明生物活性化合物具有改善受損間充質干細胞和修復衰老間充質干細胞的特性。幾項研究表明，使用生物活性化合物作為MSC移植的伴隨劑也比單獨干細胞移植具有更好的治療效果。然而，間充質干細胞的衰老是一個非常復雜的過程，徹底了解衰老的潛在機制將有助于我們找到更有效的方法來恢復衰老的間充質干細胞。

用疾病相關效應細胞或患者血清預激活間充質干細胞

“個體化間充質干細胞治療”是指通過體外預激活獲得的間充質干細胞具有定制的功能，能夠特異性地針對患者的疾病，從而達到更好的治療效果。因此，作為基于MSC治療的增強策略，直接使用效應細胞或其釋放的活性物質作為預激活條件，而不是用典型的促炎因子、細胞因子或生物活性化合物進行教育。

肥大細胞(MCs)在速發型超敏反應和過敏反應中起重要作用，也是特應性皮炎(AD)發病機制中的主要效應細胞。活化的MCs釋放含有大量生物活性物質的顆粒，如促炎細胞因子、蛋白質介質、脂質介質和生長因子，這些物質可引發過敏反應。一些研究表明，在共培養系統中，MSCs抑制MC活化和脫顆粒，并誘導MC凋亡。因此，用效應細胞或其衍生的活性物質預激活的MSCs可以準確地靶向疾病發展中的主要致病因素，并在體內快速反應和應答，以實現更高效的治療結果。

另外已經在多種疾病中發現血液循環中的炎癥因子、趨化因子、生長因子、細胞因子和微泡的改變，包括阿爾茨海默病、腎病和心臟病。它們作為疾病診斷、治療和預后的指標，以及個體間的差異。用患者來源的血清預激活擴增的間充質干細胞可能允許間充質干細胞對宿主微環境產生積極反應。

Tang等人的研究表明，與注射對照血清預激活MSCs的大鼠相比，注射中風血清預激活MSCs的大鼠在腦缺血再灌注損傷模型中表現出明顯改善的行為，炎癥細胞因子減少，腦損傷和凋亡細胞減少，營養生長因子增加。

此外，在葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎大鼠模型中也揭示了用疾病來源的血清增強間充質干細胞的治療效果。在用來自結腸炎大鼠或正常大鼠的血清預激活MSCs后，收集兩種預激活細胞的條件培養基用于治療結腸炎。與后者相比，前者在結腸炎大鼠中顯示出更有效地阻止疾病進展，更好地改善臨床特征，以及更低的組織學損傷評分。

因此，疾病特異性預激活可能是實現“MSC定制臨床治療”的一種有前途的手段，而準確捕捉疾病特異性是這一策略的必要前提，這就需要對疾病的生物學機制進行全面深入的探索和分析。

遠景展望

除了通過重建生理和病理微環境來預激活間充質干細胞之外，還有其他方法來預激活間充質干細胞，包括光刺激、磁電刺激和熱休克(HSP)等。

低水平激光療法(LLLT)有利于調節多種細胞的生物功能。例如，與未受刺激的ASCs相比，受低強度激光刺激的ASCs的生物活性增強，表現為存活率增加、分泌增加和再生愈合加快。此外，最近證明脈沖電磁場通過調節Akt/Ras信號通路和上調Bad和Bcl-xL等存活蛋白對BMSCs起保護作用。此外，研究表明，熱休克蛋白可以誘導細胞保護蛋白，增加抵抗不良外部環境的能力。

一般來說，現有的預激活方法的目的是充分利用MSCs的功能可塑性，并預先賦予MSCs所需的特性，以便當MSC再次遇到類似的環境時，啟動細胞保護機制，快速激活反應機制，并迅速做出相應的生物反應。

盡管如此，預激活間充質干細胞的應用仍面臨一些挑戰。首先是選擇合理有效的MSC預激活方法。

迄今為止，已經提出了許多補充方法來提高間充質干細胞的治療效果，尋找最佳的預激活方法是我們未來研究的重要目標。每一個預處理的目標都是改善MSCs的一個特定方面，不同策略的最佳組合可以使MSCs的治療效果最大化。

二是間充質干細胞的異質性，主要表現在兩個方面：一是不同來源間充質干細胞的生物學特性在分化、表型譜和分泌譜方面存在差異，這意味著作為一種新型細胞藥物，來自不同組織的間充質干細胞對同一疾病的治療效果不一致。有必要深入了解每種組織來源的間充質干細胞的獨特生物學特性，并結合不同的疾病模型來確定每種間充質干細胞的疾病營養特性。

第三是開發評估預激活間充質干細胞安全性和治療特性的標準平臺。大量研究證據證實，間充質干細胞主要依靠旁分泌發揮生物學效應。MSCs分泌產物的總和可視為分泌組，主要包含可溶性蛋白和細胞外小泡，其中前者包括細胞因子、趨化因子、生長因子，后者可分為外泌體和微泡(圖1)。因此，準確地選擇一種成分既作為預激活的指標又作為受教育MSCs的治療效果的指標是一個棘手的問題。然而MSCs的體內生物學機制遠比我們想象的復雜，一些抑制和對抗干細胞凋亡作為MSC預激活常用的評價指標是值得斟酌的。

初始間充質干細胞向預處理間充質干細胞向臨床治療轉化的周期，預處理的間充質干細胞獲得了良好的治療效果，增強了損傷修復和疾病恢復。

最后，MSC體內治療的本質是遞送促修復調節因子和細胞外小泡等。因此，研究人員已經開始使用MSC衍生的可溶性蛋白質和細胞外小泡來替代干細胞進行治療，其釋放受到精確的調節，并且其組成隨著預激活條件而變化。這種方法可以避免MSCs在體內增殖、分化和分泌不可預測的旁分泌因子的風險。最近的研究結果表明，通過密度梯度離心將MSCs去核為“無核細胞Cargocytes‘’，形成了一種生物啟發的遞送方法。Cargocytes保留旁分泌能力，不增殖，或永久移植在宿主體內。cargocytes的應用不僅避免了與直接使用MSCs相關的不良事件，如肺栓塞或腦栓塞，而且改善了生物分布并增強了體內靶向靶組織的能力。因此，來源于間充質干細胞的干細胞可能成為治療載體，以可控和有效的方式傳遞具有治療疾病潛力的治療藥物。

結論

總之，盡管預激活的間充質干細胞仍然存在問題，但由于其巨大的再生潛力，它們仍然為各種難治性疾病的治療提供了相當大的希望。

迄今為止，越來越多的人一致認為，在各種病理條件下，預激活的間充質干細胞確實比未激活的間充質干細胞表現出更好的治療效果。

今后，我們應該有效地利用“預激活”工具，一方面最大限度地發揮間充質干細胞的治療潛力，另一方面將其改造為適合靶向疾病，為間充質干細胞的臨床應用開啟新的篇章。（本文由公眾號“細胞PLUS”編譯，轉載請注明）

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