肌萎縮性側(cè)索硬化癥 (ALS) 是一種致命的神經(jīng)退行性疾病（漸凍癥），其特征是進(jìn)行性肌肉麻痹，這是由運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)腦干和脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化決定的。ALS 的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，盡管大量研究表明涉及幾種改變的信號(hào)通路，例如線粒體功能障礙、谷氨酸興奮性毒性、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥。

迄今為止，所提出的治療策略針對(duì)的是這些改變中的一個(gè)或幾個(gè)，對(duì)ALS患者的病程和存活率的影響很小。ALS發(fā)病機(jī)制中不同機(jī)制的參與強(qiáng)調(diào)了針對(duì)多個(gè)方面的治療方法的必要性。間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC) 可以支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和周圍細(xì)胞，減少炎癥，刺激組織再生并釋放生長(zhǎng)因子。在此基礎(chǔ)上，間充質(zhì)干細(xì)胞被提議作為治療漸凍癥的有前途的候選者。然而，由于細(xì)胞療法的缺點(diǎn)，干細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡 (EV) 的可能治療用途引起了越來越多的興趣。

意大利維羅納維羅納大學(xué)神經(jīng)科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)科學(xué)系綜述總結(jié)了肌萎縮性側(cè)索硬化癥的主要病理機(jī)制和迄今為止提出的相關(guān)治療方法，重點(diǎn)是間充質(zhì)干細(xì)胞治療漸凍癥的臨床應(yīng)用。此外，討論了EV的性質(zhì)和特征及其在概括干細(xì)胞作用中的作用，闡明了這些囊泡如何以及為什么可以為肌萎縮性側(cè)索硬化癥治療提供新的機(jī)會(huì)。MSC已被提議作為治療 ALS的有前途的候選者。

肌萎縮性側(cè)索硬化癥的發(fā)病機(jī)制

鑒定ALS中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化的分子機(jī)制對(duì)于理解疾病進(jìn)展和開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。盡管SOD1突變與ALS相關(guān)已有二十多年，但突變體SOD1的作用模式和隨后的神經(jīng)變性/神經(jīng)毒性的潛在機(jī)制仍不清楚。在這方面已經(jīng)提出了幾個(gè)假設(shè)，并且看起來可能是機(jī)制的組合，而不是單一的機(jī)制，導(dǎo)致了ALS的神經(jīng)變性，指向多因素的發(fā)病機(jī)制（圖1)。

圖1：肌萎縮側(cè)索硬化癥 (ALS) 的發(fā)病機(jī)制。該疾病的病理生理機(jī)制似乎是多因素的，有幾種機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)變性。

• 線粒體功能障礙：線粒體損傷是許多神經(jīng)退行性疾病的共同特征。
• 谷氨酸興奮性毒性：谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸前末梢合成并擴(kuò)散到突觸間隙，激活特定的突觸后受體并觸發(fā)動(dòng)作電位。
• 氧化應(yīng)激：自由基或 ROS 是氧代謝的天然產(chǎn)物。當(dāng) ROS 的產(chǎn)生高于細(xì)胞去除它們的能力時(shí)，使用術(shù)語氧化應(yīng)激。這導(dǎo)致 ROS 的積累，從而對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大分子（例如蛋白質(zhì)、DNA 和 RNA）造成不可逆轉(zhuǎn)的損害。
• 蛋白質(zhì)聚集體：蛋白質(zhì)聚集體是許多神經(jīng)退行性疾病的病理學(xué)標(biāo)志，例如阿爾茨海默氏癥、帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈癥和肌萎縮側(cè)索硬化癥。
• 神經(jīng)絲的積累：NFs在細(xì)胞體和軸突中的積累和/或聚集，以及磷酸化NFs在細(xì)胞體中的異常定位是ALS的典型病理標(biāo)志。
• 神經(jīng)炎癥：ALS和其他神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)共同特征是神經(jīng)炎癥反應(yīng)，其特征是神經(jīng)元損傷部位的小膠質(zhì)細(xì)胞活化、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。

肌萎縮性側(cè)索硬化癥的治療方法

鑒于肌萎縮性側(cè)索硬化癥發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，迄今為止還沒有有效的治療方法來治愈或顯著改善患者的生活質(zhì)量。盡管如此，已經(jīng)提出了幾種治療策略來緩解漸凍癥患者的癥狀并改善其生活質(zhì)量。

藥物治療

1994年利魯唑被批準(zhǔn)用于治療漸凍癥，但它只能延長(zhǎng)大約3個(gè)月的壽命。2017年，一種新藥依達(dá)拉奉在美國(guó)注冊(cè)。目前，利魯唑和依達(dá)拉奉(Radicava?)是唯一被FDA批準(zhǔn)的治療藥物。雖然這些藥物對(duì)生存有一定的益處，但終不能實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)或者治愈。

干細(xì)胞療法

干細(xì)胞正在成為神經(jīng)元替代和再生的一種有前途的治療方法，成為患有不同神經(jīng)退行性疾病（包括肌萎縮性側(cè)索硬化癥）的患者寄予厚望和期待的源泉。干細(xì)胞作為治療方法的使用引起了極大的興趣，因?yàn)樗鼈兡軌驓w巢到受損部位，刺激組織修復(fù)和再生，并指導(dǎo)它們響應(yīng)細(xì)胞外信號(hào)進(jìn)行分化。

干細(xì)胞是一組具有自我更新能力和分化成多種細(xì)胞類型的細(xì)胞。它們通常分為兩大亞型： 胚胎干細(xì)胞 (ESC)，起源于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有產(chǎn)生所有三個(gè)胚層的能力；成體干細(xì)胞，可以分化成不同器官的多種細(xì)胞類型的特化細(xì)胞，通常由起源的胚層決定。在不同的干細(xì)胞類型中，最常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的是：ESC、神經(jīng)干細(xì)胞 (NSC)、MSC 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC)。干細(xì)胞的最佳來源應(yīng)根據(jù)其生存、遷移至受損組織、移植和分化的生物學(xué)特性來選擇。

干細(xì)胞治療的主要目標(biāo)是細(xì)胞替代和神經(jīng)保護(hù)。第一個(gè)目標(biāo)將通過干細(xì)胞分化成與疾病有關(guān)的特定細(xì)胞亞型來實(shí)現(xiàn)，目的是替換死細(xì)胞。第二個(gè)目標(biāo)涉及基于干細(xì)胞釋放營(yíng)養(yǎng)因子和去除神經(jīng)毒性分子的能力的干細(xì)胞的使用，在受損區(qū)域的微環(huán)境中提供局部支持，充當(dāng)神經(jīng)保護(hù)者。

在用于治療神經(jīng)退行性疾病的不同類型的干細(xì)胞中，間充質(zhì)干細(xì)胞作為有前途的候選者似乎引起了最高的興趣。MSC可以從多種胎兒和成人組織中分離出來，例如骨骼肌、胎盤、臍帶、血液和脂肪組織。脂肪組織越來越受到關(guān)注，因?yàn)樗梢詮奈g(shù)中大量獲得，從而允許脂肪來源的MSC (ASC) 的自體移植。

MSC的應(yīng)用有幾個(gè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)。首先，它們的分離是安全和容易的，它們?cè)隗w外的擴(kuò)增很簡(jiǎn)單，而且在體外和體內(nèi)都證明它們可以分化成神經(jīng)樣、神經(jīng)膠質(zhì)樣和星形細(xì)胞樣細(xì)胞。考慮到自體移植的可能性，MSC 對(duì)腫瘤變化的敏感性較低，并且不需要免疫抑制治療來防止排斥反應(yīng)。此外，與其他干細(xì)胞一樣，移植和遷移后，MSC會(huì)被吸引到受損區(qū)域，在那里它們會(huì)增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放。

干細(xì)胞移植治療漸凍癥的臨床試驗(yàn)

在過去的幾年中，許多基于細(xì)胞的ALS臨床試驗(yàn)都使用了MSC，并報(bào)告了MSC對(duì)ALS患者給藥的可行性、安全性和免疫學(xué)效果（表2)。

干細(xì)胞類型	移植方式/細(xì)胞數(shù)量	試用狀態(tài)和詳細(xì)信息	參考
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	椎管內(nèi)（14–60×106個(gè)細(xì)胞）	該方法安全可行。一些患者表現(xiàn)出神經(jīng)肌電圖改善	德達(dá)等人(2009)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	鞘內(nèi)（54.7×106±17.4×106個(gè)細(xì)胞） 靜脈內(nèi)（23.4±6×106個(gè)細(xì)胞）	該方法安全、可行，并可立即產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。I期完成，II期開放以評(píng)估不同劑量細(xì)胞的初步效果	Karussis 等人(2010年)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	椎管內(nèi)（15–110×106個(gè)細(xì)胞）	該方法安全可行，沒有毒性、不良事件或異常細(xì)胞生長(zhǎng)的跡象。第一階段完成；無長(zhǎng)期有害后果，但疾病進(jìn)展似乎并未減緩	馬志尼等人( 2010); 馬志尼等人。(2012)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	椎管內(nèi)（138–602.87×10 6 個(gè)細(xì)胞）	該方法安全可行。尸檢后未發(fā)現(xiàn)衰退加速，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量增加	布蘭克等人(2012)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	腦室內(nèi)（1×106個(gè)細(xì)胞/kg）	該方法安全可行	貝克等人(2012)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	運(yùn)動(dòng)皮層（2.5–7.5×105個(gè)細(xì)胞）	該方法安全可行，接受治療的患者具有更高的顯著生存率	馬丁內(nèi)斯等(2009); 馬丁內(nèi)斯等。(2012)
自體BM-MSC和神經(jīng)誘導(dǎo)的MSC	靜脈內(nèi)（42–102×106個(gè)細(xì)胞）和腰椎內(nèi)（5–9.7×102×106個(gè)細(xì)胞）	該方法安全，延緩疾病進(jìn)展，提高患者生活質(zhì)量	Rushkevich等人(2015年)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	鞘內(nèi)（1–2×106個(gè)細(xì)胞） 肌內(nèi)（1–48×106個(gè)細(xì)胞）	該方法安全可行。I期完成，II期開放以評(píng)估不同劑量細(xì)胞的初步效果	彼得魯?shù)热? 2016 年)

然而，盡管干細(xì)胞介導(dǎo)的療法代表了一種治療ALS和其他神經(jīng)退行性疾病的新方法，但迄今為止，與安慰劑治療的對(duì)照相比，尚未獲得對(duì)疾病進(jìn)展的顯著影響，并且在廣泛的臨床轉(zhuǎn)化之前需要解決關(guān)鍵問題。

首先，有必要使用標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議確定細(xì)胞向CNS的輸送，并考慮給藥途徑、細(xì)胞劑量、時(shí)間和細(xì)胞注射次數(shù)。此外，鑒于干細(xì)胞的高增殖能力，應(yīng)防止移植細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)化并避免其免疫排斥。

在證明只有一小部分注射的干細(xì)胞可以到達(dá)損傷部位、移植和分化后，干細(xì)胞的有益作用是間接的并且很可能取決于它們的旁分泌活動(dòng)的想法變得越來越普遍。干細(xì)胞產(chǎn)生大量含有細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)和核酸的EV，并且可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生顯著影響，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。這些觀察結(jié)果導(dǎo)致了這樣的假設(shè)，即干細(xì)胞通過分泌EV發(fā)揮其有益作用，從而增強(qiáng)受損區(qū)域釋放其內(nèi)容物的修復(fù)。因此，EV可以用作一種新型的無細(xì)胞治療方法，避免與使用細(xì)胞相關(guān)的所有風(fēng)險(xiǎn)。

細(xì)胞外囊泡

細(xì)胞間通訊在多細(xì)胞生物中起著重要作用。它可以通過細(xì)胞之間的直接接觸或通過分泌分子（例如生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子）來介導(dǎo)，從而對(duì)附近的細(xì)胞產(chǎn)生影響。在過去的幾十年中，提出了一種新的細(xì)胞通訊機(jī)制，涉及EV的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。這些囊泡代表了在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的載體，成為細(xì)胞間微環(huán)境的組成部分，并在許多生理和病理過程中發(fā)揮作用。

外泌體的治療應(yīng)用

由于外泌體和微泡可以遠(yuǎn)距離傳遞生物信息，因此越來越多的人關(guān)注這些囊泡作為病理過程抑制因子的促進(jìn)劑。由于外泌體比微泡小并且能夠穿過血腦屏障，在這里我們將重點(diǎn)關(guān)注外泌體作為神經(jīng)退行性疾病（例如肌萎縮性側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默氏癥和帕金森氏病）的潛在治療工具的用途。

越來越多的證據(jù)表明外泌體具有抗炎特性，可減少活化的炎癥小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，支持少突膠質(zhì)細(xì)胞并保護(hù)神經(jīng)元。此外，鼻內(nèi)注射的外泌體被迅速輸送到大腦，在那里它們可以被小膠質(zhì)細(xì)胞吸收。由于如上所述，神經(jīng)炎癥是神經(jīng)退行性疾病的共同特征，神經(jīng)炎癥反應(yīng)的抑制和容易到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可能性對(duì)于治療這些病癥非常重要。

使用外泌體治療神經(jīng)退行性疾病的越來越多的關(guān)注源于外泌體穿過血腦屏障的能力，血腦屏障是將腦實(shí)質(zhì)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的循環(huán)血液分開的生理屏障。如前所述，目前對(duì)神經(jīng)退行性疾病的治療通常是有癥狀的，不會(huì)阻止退化過程；治愈這些病癥的主要問題是細(xì)胞和藥物無法穿過血腦屏障。最近的研究報(bào)告說，與微泡不同，外泌體可以穿過血腦屏障：假設(shè)是外泌體被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化，并且通過釋放特定的貨物，它們影響細(xì)胞連接的完整性，增加細(xì)胞之間的滲透性并允許大量進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的囊泡，在那里他們可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用（圖2)。

結(jié)論和未來展望

科學(xué)界對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞作為神經(jīng)退行性疾病的潛在治療方法的興趣是由于它們能夠遷移到受損組織、分化并促進(jìn)修復(fù)過程。除了這些特點(diǎn)，ASC也很容易獲得，可用于自體移植，避免可能的細(xì)胞排斥反應(yīng)。這些特性使ASC 成為基于細(xì)胞替代和細(xì)胞分化的細(xì)胞療法的候選者。由于ASC的有益作用可能是由于旁分泌活動(dòng)而不是它們的植入，因此科學(xué)界已將重點(diǎn)從細(xì)胞轉(zhuǎn)移到EV，由于其內(nèi)容，EV可以重現(xiàn)ASC效應(yīng)，并可能為用于治療ALS的非細(xì)胞療法。這種創(chuàng)新療法很容易轉(zhuǎn)移到ALS患者身上，因?yàn)镋V將從自體ASC中獲得，并且會(huì)保留其來源的免疫特性，避免免疫原性反應(yīng)。

鑒于EV可能應(yīng)用于ALS，囊泡需要穿過BBB才能到達(dá)損傷部位，并且在EV中，外泌體具有所需的特性。為了測(cè)試外泌體在ALS中的作用，我們最近證明，在ALS的體外模型中施用外泌體在氧化損傷后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，支持外泌體可以概括和改善干細(xì)胞療法的神經(jīng)保護(hù)作用的觀點(diǎn)。

主要參考資料：

[1]:Bonafede R, Mariotti R. ALS Pathogenesis and Therapeutic Approaches: The Role of Mesenchymal Stem Cells and Extracellular Vesicles. Front Cell Neurosci. 2017 Mar 21;11:80. doi: 10.3389/fncel.2017.00080. PMID: 28377696; PMCID: PMC5359305.

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